De vier schilderijen zijn allemaal onderzocht met natuurwetenschappelijke methoden zoals Röntgen-opnamen, infraroodfotografie en infraroodreflectografie (IRR). IRR is een techniek waarbij infraroodlicht wordt gebruikt om verf- en tekenmaterialen te doordringen. Alle materialen kunnen doordrongen worden met uitzondering van die die koolstof bevatten. Deze techniek wordt vooral gebruikt om de ondertekening - de tekening die de kunstenaar op het schilderij aan brengt voordat hij gaat schilderen - te bestuderen. In de 15de en 16de eeuw worden hiervoor namelijk veelal materialen gebruikt die koolstof bevatten, zoals eveneens het geval is met deze vier schilderijen. Röntgenopnamen vullen dit beeld aan omdat daarmee de verschillende verflagen en eventuele wijzigingen tussen de verflagen onderscheiden kunnen worden.

Vooral het schilderij in Boston geeft een interessant beeld. Uit onderzoek met zowel röntgen als IRR blijkt dat de kunstenaar tal van kleine wijzigingen heeft doorgevoerd. Zo houdt Maria haar hoofd iets minder naar voren gebogen, zijn de beentjes van Jezus van positie veranderd, is Lucas'gezicht iets hoger en meer in drie kwart geschilderd en is zijn hoed van vorm veranderd. De meest spectaculaire vondst is een engel die het baldakijn boven het hoofd van Maria vasthoudt, die in de ondertekening is vastgelegd. Hij is nooit uitgewerkt in verf.

Een aantal andere, kleine wijzigingen hebben samen tot doel gehad de ruimtesuggestie van het schilderij te verbeteren. De draperieën van de mantels van Maria en Lucas bedekten in eerste instantie grotere delen van de vloer. Door de draperieën kleiner te tekenen, lijkt het alsof er meer ruimte tussen de twee figuren bestaat. Ten tweede zijn de vestingswerken links in het werk aangepast zodat het perspectief sterker wordt. De kantelen van de vestingswerken en de muur om het binnenhofje, en de figuurtjes die er voor staan, zijn verkleind. Als laatste is ook de rivier breder geschilderd dan zij ondertekend is.

In tegenstelling tot de verschillende wijzigingen in het schilderij in Boston, heeft het natuurwetenschappelijk onderzoek van de schilderijen in Brugge, Sint Petersburg en München geen wijzigingen 'blootgelegd'. Alle drie de schilderijen volgen nauwkeurig de compositie van het verfoppervlak van het Bostonse schilderij. Dat betekent dat de drie anonieme kunstenaars gewerkt hebben naar het voltooide schilderij in Boston. De kunstenaar van het schilderij in München heeft zelfs het schilderij uit Boston overgetrokken en dat als basis gebruikt voor zijn schilderij. Mogelijk is dit ook het geval in het Brugse schilderij, maar dit moet door onderzoek bevestigd worden.